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RN 系统助力肿瘤免疫治疗研究领域

发布时间:2017-09-15 16:35 |  点击次数:

基于 ACEA RN 系统
监测免疫效应细胞的细胞杀伤功能和细胞因子分泌

 
肿瘤免疫治疗是应用免疫学原理和方法,提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性,激发和增强机体抗肿瘤免疫应答,并应用免疫细胞和效应分子输注宿主体内,协同机体免疫系统杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长 [1],从而达到治疗疾病的目的。免疫治疗是目前肿瘤领域的研发热点,因其在某些肿瘤疾病上卓越的疗效和创新性,被《科学》杂志评为 2013 年最重要的科学突破 [2]。临床上将免疫治疗与手术、放疗、化疗和靶向治疗有机地结合起来,是今后肿瘤治疗发展的趋势。

细胞毒性 T 细胞(CTL)是肿瘤免疫的主要途径,通过释放细胞毒性介质或促发靶细胞上的死亡受体而直接溶解靶细胞,或通过分泌 IFN-γ间接杀伤肿瘤细胞,在机体发挥免疫监视作用。双特异性单链抗体(BiTE)含有两个抗原的结合位点,一个为针对 T 细胞表面抗原 CD3 的特异位点,另一个为靶细胞特异位点,它可以介导 T 细胞识别靶细胞,从而活化 T 细胞,释放颗粒酶、穿孔素等活性物质,溶解杀伤靶细胞 [3]。

免疫细胞活化和对靶向肿瘤细胞的杀伤过程的体外研究,对于探索新的更有效的肿瘤免疫治疗方法至关重要。本文旨在建立一个整合的检测平台-ACEA 推出的 RN 系统, 细胞治疗研究中的核心技术平台,该系统由两部分组成:RTCA 实时无标记细胞分析仪和 NovoCyte 流式细胞仪组成。实现免疫效应细胞杀伤功能的实时检测,和细胞因子分泌的检测,为评估免疫治疗的临床疗效,预测可能由细胞因子引起的临床毒副作用提供有力工具。该检测平台基于实时细胞分析(Real Time Cell Analysis,RTCA)技术和流式细胞技术,实时监测原代 T 细胞与 CD19-BiTE 抗体(双特异性 CD19 靶向 CD3 T 细胞募集抗体,Bi-specific CD19-directed CD3 T-cell engager)共同作用下,靶向杀伤 B 肿瘤细胞 Daudi 细胞的过程,并检测 T 细胞活化引起的细胞因子分泌和杀伤靶细胞的毒性介质的分泌。

1. RTCA 方法实时检测免疫效应细胞的细胞杀伤功能

基于阻抗的 RTCA 方法将细胞接种到光刻金电极的 E-plate 底部,细胞接种后导致阻抗上升,阻抗的上升与细胞数量、大小、细胞黏附状态相关。RTCA 方法无需任何标记,通过实时检测电极的阻抗变化,以 Cell Index 反应细胞生长和细胞活性。

RTCA 方法检测 T 细胞与 CD19-BiTE 共同作用杀伤 Daudi 细胞的过程,采用 xCELLigence Immunotherapy B Cell Killing (anti-CD40) Assay(ACEA Biosciences, Cat# 8100004)将 Daudi 细胞接种在 xCELLigence 96 孔 E-Plate 底部,获取 Daudi 细胞增殖 Cell Index 曲线,18 小时后以 10:1 效靶比加入原代 T 细胞和 CD19-BiTE 抗体或对照 CD19 抗体,在 xCELLigence MP 系统上实时监测 Daudi 细胞的生长和活性。

原代 T 细胞与 CD19-BiTE 抗体共同作用,有效地介导靶细胞 Daudi 细胞的杀伤,Cell Index 曲线下降(图 1A 绿色线),T 细胞作用 24 小时和 48 小时的杀伤率分别达到 40% 和 77%(图 1B CD19-BiTE)。相反,原代 T 细胞和对照 CD19 抗体对 Daudi 细胞活性没有影响(图 1A 紫色线,图 1B Control),Cell Index 曲线与未加入 T 细胞处理仅接种 Daudi 细胞的曲线(图 1A 蓝色线)一致。

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图 1. RTCA 方法实时检测免疫效应细胞的细胞杀伤功能。用 xCELLigence Immunotherapy B Cell Killing (anti-CD40) Assay(ACEA Biosciences, Cat# 8100004)将 Daudi 细胞接种在 xCELLigence 96 孔 E-Plate 底部,18 小时后以 10:1 效靶比加入原代 T 细胞和 CD19-BiTE 抗体或对照 CD19 抗体,T 细胞处理前后均在 xCELLigence MP 系统上实时监测 Daudi 细胞的生长和活性。
A. xCELLigence MP 系统实时监测 Daudi 细胞中 T 细胞处理前后的细胞增殖和反应曲线;
B. RTCA 分析得到的 Daudi 细胞杀伤率。原代 T 细胞与 CD19-BiTE 抗体共同作用,有效地介导靶细胞 Daudi 细胞的杀伤,T 细胞作用 24 小时和 48 小时杀伤率分别达到 40% 和 77%。相反,原代 T 细胞和对照 CD19 抗体对 Daudi 细胞活性没有影响。

2. 基于流式的多细胞因子检测方法检测细胞因子分泌

为进一步研究 CD19-BiTE 抗体促进 T 细胞活化的作用,及 T 细胞识别靶细胞并发挥细胞杀伤作用下细胞毒性介质的释放,基于流式多细胞因子检测方法检测炎症因子(IFN-g、TNF-a、IL-17A、IL-10、IL-2、IL-6、IL-4)和细胞毒性介质(Granulysin、Granzyme B、Perforin、Granzyme A、sFasL、sFas)等细胞因子的分泌。

在 T 细胞和 CD19-BiTE 抗体共同作用 7 小时、24 小时和 48 小时后,取 RTCA 实验 E-plate 中的细胞培养上清,使用 Biolegend 多细胞因子检测试剂盒(LEGENDplex™ Multi-Analyte Flow Assay Kit Human CD8/NK panel)制备样本,在 NovoCyte 3000 流式细胞仪上检测细胞因子的分泌。

与 RTCA 检测到的 T 细胞杀伤进程一致,CD19-BiTE 抗体作用于 T 细胞,导致多个 CTL 活化相关炎症因子(IFN-g 和 TNF-a)的释放,同时 T 细胞和 CD19-BiTE 抗体共同作用发挥细胞杀伤作用,分泌细胞毒性介质(Granulysin、Granzyme B、Perforin、Granzyme A、sFasL)。从细胞因子分泌的时间动力学上看,大部分炎症因子(IFN-g、TNF-a、IL-2、IL-6、IL-4)浓度在 24 小时达到峰值,而细胞毒性介质(Granulysin、Granzyme B、Perforin、Granzyme A、sFasL)浓度在 48 小时达到峰值。

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图 2. 基于流式的多细胞因子检测方法检测细胞因子分泌。在 T 细胞和 CD19-BiTE 抗体共同作用 7 小时、24 小时和 48 小时后,取 RTCA 实验 E-plate 中的细胞培养上清,使用 Biolegend 多细胞因子检测试剂盒(LEGENDplex™ Multi-Analyte Flow Assay Kit  Human CD8/NK panel)制备样本,在 NovoCyte 3000 流式细胞仪上检测细胞因子的分泌。
A. 炎症因子;
B. 细胞毒性介质。

3. 流式 7-AAD 法检测原代 T 细胞介导的 Daudi 细胞杀伤作用与 RTCA 方法检测结果高度一致

为了进一步研究 RTCA 方法与传统检测方法的一致性,我们采用基于流式的细胞杀伤方法对原代 T 细胞的介导的 Daudi 细胞杀伤作用进行了平行检测 [4]。

流式 7-AAD 法采用 CFSE 预标记 Daudi 细胞,将标记后的细胞接种在细胞培养板中,18 小时后以 10:1 效靶比加入原代 T 细胞和 CD19-BiTE 抗体或对照 CD19 抗体,T 细胞作用 48 小时后,加入 7-AAD,用 NovoCyte 3000 流式细胞仪检测 CFSE 阳性的 Daudi 细胞对 7-AAD 的吸收。

流式 7-AAD 法检测结果表明,原代 T 细胞与 CD19-BiTE 抗体共同作用 48 小时,对 Daudi 细胞的杀伤率为 74%,与无标记 RTCA 方法得到的杀伤率(77%)高度一致(图 3)。
 
 


 
图 3. 基于流式的 7-AAD 法检测原代 T 细胞与 CD19-BiTE 抗体共同作用下介导的 Daudi 细胞杀伤。T 细胞作用 48 小时,对 Daudi 细胞的杀伤率为 74%,与 RTCA 结果(77%)高度一致。CFSE 预标记 Daudi 细胞后,将细胞接种在细胞培养板中,18 小时后以 10:1 效靶比加入原代 T 细胞和 CD19-BiTE 抗体或对照 CD19 抗体,T 细胞作用 48 小时后,加入 7-AAD,用 NovoCyte 3000 流式细胞仪检测 CFSE 阳性的 Daudi 细胞对 7-AAD 的吸收。
 

 
本文通过 RN 系统,整合基于阻抗的 RTCA 技术和细胞因子流式检测技术,实现了在时间及剂量二度空间同时监测免疫细胞诱导靶细胞杀伤的功能,以及细胞因子的分泌。RN 系统在肿瘤免疫治疗研究领域的各个方向(NK 细胞、T 细胞、CAR-T、溶瘤病毒、免疫检查点抑制剂、双特异性抗体、BiTE 等)均有巨大的应用潜力,为科研成果转化为临床应用提供了强大的工具。

参考文献
[1]     周光炎主编.《免疫学原理》. 上海. 上海科学技术出版社. 2014 年第 3 版
[2]     Breakthrough of the year 2013. Notable developments. Science. 2013; 342 (6165):1435-41
[3]     Baeuerle PA, Reinhardt C. Bispecific T-Cell Engaging Antibodies for Cancer Therapy. Cancer Res. 2009; 69(12):4941-4944
[4]     Zaritskaya L, Shurin MR, et al. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 2010; 9(6): 601–616