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艾森 NovoCyte 体积法与微球法绝对计数比较

发布时间:2016-06-08 09:02 |  点击次数:

摘要:

由于特定细胞群体的绝对计数在临床诊断、治疗及预后等方面均具有重要意义,因此绝对计数在流式临床诊断中有着广泛的应用,如白细胞计数、血小板计数、CD4+T 细胞计数检测艾滋病及 CD34+造血干细胞计数等。

其中 CD4+T 淋巴细胞计数在艾滋病防治中起着重要作用,但传统流式细胞仪由于技术手段所限,只能采用向样本中加入已知数量的参考微球,根据微球数量来推断 CD4+T 淋巴细胞的绝对数量,这样的方法不但操作繁琐且推高了检测成本,并且如果加入的微球数量错误反而可能得出错误的结论。本文以 CD4+T 淋巴细胞计数为例,详细介绍了 NovoCyte 新颖的体积法绝对计数与传统的微球法进行绝对计数的比较,从比较的数据看,两种方法均有极高的一致性,且体积法操作更为简单,并且避免了参考微球计数所带来的误差。Novocyte 的体积法绝对计数法已经得到众多用户认可,已在多家顶级医院应用于临床检验,得到了极高的评价。

一,概述

HIV 侵入人体后主要攻击的是一种带 CD4 抗原的淋巴细胞(辅助性 T 淋巴细胞)。这种细胞是免疫系统的基本组成部分,HIV 通过大量、不断地复制与释放,导致 CD4+T 淋巴细胞进行性下降,感染者免疫功能遭到严重破坏,造成免疫缺陷。临床表现为各种各样机会性感染与肿瘤。

人体感染 HIV 后,CD4 细胞的数量与功能的降低是引起人体免疫功能缺陷的主要原因。CD4 细胞的数量是确定诊断、疾病分期、制定抗病毒治疗和预防机会性感染方案的标准实验指标。目前 CD4 细胞的测定已广泛应用于 HIV 感染者的临床管理,协助判断感染者的预后、指导实施抗病毒治疗和疗效观察以及药物预防机会性感染等多个方面,同时它也是 WHO 对艾滋病发病定义的金标准。当前,大多数流式细胞仪计数要借助标准参考微球作为参考。ACEA NovoCyte 精确控制进样体积,为 CD4+ 绝对计数提供了一个精确、经济、简便的方法。

二,数据比较



表 1. 艾滋病患者外周血用 CD3 PereCP/CD4 FITC/CD8 PE 抗体标记,ACEA NovoCyteTM2060 流式细胞仪及另一品牌流式细胞仪同时采集数据。NovoExpressTM 对数据进行分析。表 1 记录了各样本细胞浓度。

线性回归分析如下:



NovoCyeTM 流式细胞仪与其他品牌流式获取的数据对比,具有良好的线性回归。



正常人外周血与 QC 质控血分别用 CD3 PereCP/CD4 FITC/CD8 PE 抗体标记,ACEA NovoCyteTM2060 流式细胞仪及另一品牌流式细胞仪同时采集数据。NovoExpressTM 对数据进行分析。表 2 记录了各样本细胞浓度。

线性回归分析



NovoCyeTM 流式细胞仪与其他品牌流式获取的数据对比,具有良好的线性回归。

三,流式细胞术测定细胞绝对计数的方法

根据《中华人民共和国卫生行业标准 WS/T 360-2011 流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》,流式细胞术测定细胞绝对计数的方法分为双平台法(Dual-platform Method, DP)和单平台法(Single-platform Method, SP),由于双平台法需使用除流式细胞仪外的第二种仪器对同一标本靶细胞群的绝对数量进行分析,因此该方法实际包含了两种体系的系统误差,目前已经很少采用。

目前较为常用的方法是采用单平台法,其绝对数量的测量可以直接通过测定体积的方法或间接通过加入已知数量的参考微球的方法来进行计算。由于传统流式细胞仪技术手段限制,只能通过加入已知数量的参考微球的方法或是使用计数管(计数管中已经加入已知数量的参考微球)进行检测。NovoCyte 通过创新性引入高精度注射泵,从而可以精确测量样本体积,因此无需计数微球即可根据体积测定直接得到绝对计数结果。



四,ACEA NovoCyteTM 流式细胞仪体积法绝对计数的原理:

NovoCyteTM 采用高精度注射泵吸取样本,然后将样本推入流动室,进行检测。该进样方式可以精确控制样本体积量,通过采集到的细胞数目、样本体积、总体积、绝对数目单位计算得到单位体积内特定细胞的总数。

Abs. Count = Count / Ve / Df / Abs.Unit

其中 Count 是群的事件数目,Ve 是实验样本体积,Df 是稀释比例,Abs. Unit 是绝对数目单位。稀释比例、绝对数目单位可在「样本」菜单的「绝对计数设置」中进行设置,自动生成结果。



五,其它检测数据比较

Donato Koyalta 等人对艾滋病人两种方法的研究表明,体积法绝对计数与微球法绝对计数结果具有很高的一致性,对 76 个儿童患者两种检测方法的相关系数 r=0.98,bias=30.0 个/ul;对 182 个成年患者两种检测方法的相关系数 r=0.99,bias=-16.0 个/ul .

与中国疾控中心合作在广西疾控对 227 例病例的检测中,也表明体积法与微球法绝对计数结果具有高度的一致性,这两种检测方法的相关系数 r2=0.9806,bias=11.6 个/ul;在四川疾控对 78 例病例的检测中也表明两种方法的高度一致性,其相关系数 r=0.9716,bias=6.6 个/ul.


r2=0.9806                            bias=11.6 个/ul   227 例广西疾控病例检测结果比较


R2 = 0.9716                                  bias=6.6 个/ul   四川疾控 78 例病例检测结果比较

六,结论

无论是国外的研究成果还是国内的研究结果均表明体积法与微球法对细胞绝对计数的检测结果具有高度的一致性,且体积法计数方法更为简单,影响因素更少,且节省检测成本,是一个值得推广的新型细胞绝对计数方法。

参考文献:

北京市临床流式细胞分析协作组。 流式细胞仪单平台技术调查成年人外周血 T 淋巴细胞亚群绝对计数参考范围。 中华检验医学杂志, 2003, 26:123~125

中华人民共和国卫生行业标准 WS/T 360-2011 流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南

Sprent, J. 「T lymphocytes and thymus」, 1989, Fundamental immunology, 2nd edition, paul W.E. Raven Press, P.69-93.

Donato Koyalta, et. al. Single-platform, volumetric, CD45-assisted pan-leucogating flow cytometry for CD4 T lymphocytes monitoring of HIV infection according to the WHO recommendations for resource-constrained settings. BMC Research Notes 2013, 6:169